Plásmido CRISPR de Activación (h) MEK Kinase-4: sc-404345-ACT

El gen humano MAP3K4 codifica la MEK cinasa-4 (también conocida como MTK1), una cinasa cinasa cinasa de MAP que actúa aguas arriba de las cascadas MAPK de JNK y p38. Como nodo de señalización sensible al estrés y a citocinas, la MEK cinasa-4 ayuda a acoplar señales ambientales y del desarrollo con programas transcripcionales que controlan la apoptosis, la diferenciación y las respuestas inflamatorias. La actividad de MAP3K4 contribuye a la regulación del “cross-talk” mediado por MAPK con la señalización de daño en el ADN y la adaptación celular al estrés, procesos que con frecuencia se ven alterados en la biología del cáncer y en la desregulación inmunitaria. La señalización MAP3K4–JNK/p38 desregulada se ha implicado en decisiones de destino celular alteradas y en respuestas aberrantes al estrés oxidativo y genotóxico, lo que respalda su utilidad como modulador de la vía en estudios mecanísticos.

MEK Kinase-4 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de MAP3K4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

MEK Kinase-4 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus MAP3K4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional MAP3K4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de MEK Kinase-4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo MAP3K4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de MEK Kinase-4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía MEK Kinase-4 en células tumorales con expresión de MAP3K4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.