megalin/LRP2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401094-ACT

LRP2 kodiert Megalin, einen multiliganden Endozytoserezeptor aus der LDL-Rezeptorfamilie, der stark in resorptiven Epithelien exprimiert wird und die clathrinabhängige Internalisierung verschiedenster Proteinliganden, Vitamine sowie Hormon-Trägerkomplexe vermittelt. Megalin/LRP2 koordiniert die rezeptorvermittelte Aufnahme und den Transport zu Endosomen und Lysosomen, trägt zur epithelialen Polarität, zur Nährstoffhomöostase und zur Clearance extrazellulärer Proteine bei und ist funktionell mit Signalwegen verknüpft, an denen Cubilin/AMN, die Verarbeitung von Albumin und Vitamin‑D‑Bindungsprotein sowie lipoproteinassoziierte Liganden beteiligt sind. Im Nervensystem und in anderen Geweben wird LRP2 zudem mit der Regulation morphogener Signalgebung in Verbindung gebracht, einschließlich der Modulation der Verfügbarkeit von Sonic hedgehog und BMP während der Entwicklung. Eine genetische oder funktionelle Störung von LRP2 ist mit syndromalen Entwicklungsphänotypen und Defekten der tubulären Proteinrückresorption in der Niere assoziiert, was es für Studien zu epithelialem Transport, Entwicklungssignalgebung und Rezeptor-Trafficking relevant macht.

megalin/LRP2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen LRP2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

megalin/LRP2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des LRP2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der LRP2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen megalin/LRP2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native LRP2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von megalin/LRP2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des megalin/LRP2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem LRP2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.