Plásmido CRISPR de Activación (h) MDM2: sc-400045-ACT

MDM2 codifica una ligasa E3 de ubiquitina que actúa como el principal regulador negativo de TP53, promoviendo la ubiquitinación de p53, su exportación nuclear y su degradación proteasómica para limitar las respuestas al daño del ADN. Mediante regulación por retroalimentación e integración con la señalización de ATM/ATR, MDM2 influye en los puntos de control del ciclo celular, la apoptosis, la senescencia y programas transcripcionales de adaptación al estrés. La expresión o actividad desregulada de MDM2 puede modificar la salida funcional de la vía de p53 y se estudia con frecuencia en cánceres en los que la proteostasis alterada y el control de los checkpoints contribuyen a la aptitud de las células tumorales. MDM2 también interactúa con otras redes, incluidas la proliferación mediada por RB/E2F y la señalización PI3K–AKT, lo que la convierte en un nodo útil para el mapeo de vías y la genómica funcional.

MDM2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de MDM2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

MDM2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus MDM2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional MDM2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de MDM2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo MDM2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de MDM2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía MDM2 en células tumorales con expresión de MDM2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.