MDH2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402825-ACT

Das humane MDH2 kodiert die mitochondriale Malatdehydrogenase, die die reversible Umwandlung von Malat zu Oxalacetat unter Verwendung von NAD+/NADH katalysiert und damit einen zentralen enzymatischen Schritt im Tricarbonsäure-(TCA-)Zyklus bereitstellt. Durch die Verknüpfung des mitochondrialen Redoxgleichgewichts mit dem oxidativen Stoffwechsel unterstützt MDH2 die ATP-Produktion, anaplerotische Flüsse und die metabolische Kopplung zwischen Glykolyse, TCA-Zyklus und Aminosäurebiosynthese. Die MDH2-Aktivität beeinflusst zelluläre Antworten auf die Nährstoffverfügbarkeit und mitochondrialen Stress, mit nachgelagerten Effekten auf den Umgang mit reaktiven Sauerstoffspezies und die bioenergetische Anpassung. Eine veränderte MDH2-Expression oder -Funktion wurde mit der metabolischen Reprogrammierung in proliferativen und neurodegenerativen Kontexten in Verbindung gebracht, was MDH2 für Studien zu mitochondrialer Dysfunktion und redoxabhängiger Signalübertragung relevant macht.

MDH2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MDH2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MDH2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MDH2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MDH2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MDH2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MDH2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MDH2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MDH2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MDH2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.