MCT3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403973-ACT

SLC16A8 kodiert den Monocarboxylat-Transporter 3 (MCT3), einen protonengekoppelten Transporter, der den transmembranären Transport von Laktat und anderen kurzkettigen Monocarboxylaten vermittelt und damit das zelluläre Redoxgleichgewicht sowie die pH-Homöostase unterstützt. Die MCT3-Aktivität trägt zur metabolischen Kopplung zwischen Zellen bei, indem sie die Laktatverwertung erleichtert, und steht in Wechselwirkung mit glykolytischem und oxidativem Stoffwechsel; dadurch beeinflusst sie die intrazelluläre Ansäuerung und die Verfügbarkeit von Energiesubstraten. Im menschlichen Auge ist SLC16A8 im retinalen Pigmentepithel besonders stark exprimiert; dort unterstützt es den Laktat-Export aus der äußeren Retina und hilft, das metabolische Mikromilieu der Photorezeptoren aufrechtzuerhalten. Genetische Varianten und eine veränderte Expression von SLC16A8 wurden in humangenetischen Studien mit Phänotypen retinaler Degeneration sowie einem erhöhten Risiko für altersbedingte Makuladegeneration in Verbindung gebracht, was mechanistische Untersuchungen des Laktattransports für die Gesundheit der Retina und Stressantworten motiviert.

MCT3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC16A8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MCT3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC16A8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC16A8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MCT3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC16A8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MCT3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MCT3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC16A8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.