MCR CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400672-ACT

NR3C2 kodiert den Mineralokortikoidrezeptor (MCR), einen ligandenaktivierten nukleären Rezeptor-Transkriptionsfaktor, der in erster Linie auf Aldosteron reagiert und gewebespezifisch auch an der Glukokortikoid-Signalübertragung beteiligt ist. Nach Aktivierung transloziert der MCR in den Zellkern und bindet an Hormon-Response-Elemente, um Gene zu regulieren, die den epithelialen Natriumtransport, die Kaliumhomöostase, den Flüssigkeitshaushalt und die Blutdruckregulation steuern, einschließlich Signalwege, die auf die Aktivität von ENaC und der Na⁺/K⁺-ATPase zusammenlaufen. Die NR3C2-Signalgebung überschneidet sich zudem mit entzündlichen und fibrotischen Genprogrammen in kardiovaskulären, renalen und neuronalen Geweben, vermittelt durch kontextabhängigen Crosstalk mit MAPK und anderen transkriptionellen Regulatoren. Eine Fehlregulation oder Mutation von NR3C2 wird mit Störungen der Salzhandhabung und der Blutdruckkontrolle in Verbindung gebracht und in Zusammenhang mit Mechanismen von Nieren- und Herzerkrankungen, stressresponsiver Neurobiologie sowie endokriner Regulation untersucht.

MCR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NR3C2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MCR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NR3C2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NR3C2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MCR-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NR3C2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MCR-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MCR-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NR3C2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.