MBOAT5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403597-ACT

LPCAT3 (nota anche come MBOAT5) codifica un’O-aciltransferasi associata alla membrana che rimodella i fosfolipidi attraverso il ciclo di Lands, catalizzando il trasferimento di catene aciliche alla lisofosfatidilcolina per contribuire a mantenere la composizione di membrana e la disponibilità di lipidi di segnalazione. Modellando i pool di fosfolipidi polinsaturi, MBOAT5 influenza processi dipendenti dalla membrana, tra cui il traffico vescicolare, la segnalazione recettoriale e le risposte allo stress ossidativo legate alla sensibilità alla perossidazione lipidica. Alterazioni nel rimodellamento dei fosfolipidi sono state associate a fenotipi metabolici e infiammatori, rendendo MBOAT5 un nodo rilevante per lo studio dell’omeostasi lipidica e dei programmi di adattamento allo stress. L’analisi funzionale di questa via è comunemente applicata a modelli di disfunzione epatica e cardiometabolica, attivazione immunitaria e transizioni di stato cellulare guidate dai lipidi.

MBOAT5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LPCAT3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MBOAT5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LPCAT3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LPCAT3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MBOAT5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LPCAT3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MBOAT5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MBOAT5 nelle cellule tumorali con espressione di LPCAT3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.