MATH-2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404019-ACT

NEUROD6 (MATH-2) ist ein basischer Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktor, der während der menschlichen Neuroentwicklung Programme zur Festlegung der neuronalen Zelllinie, zur Differenzierung und zur Reifung reguliert. Durch die Bindung an E-Box-Motive koordiniert MATH-2 Genexpressionsnetzwerke, die das Neuritenauswachsen, synaptische Funktionen und das Überleben von Neuronen steuern, und ist in entwicklungsbedingte transkriptionelle Kaskaden eingebunden, die die Schaltkreise von Kortex und Hippocampus formen. Die Aktivität von NEUROD6 ist mit Zellschicksalsentscheidungen und erregbarkeitsbezogenen Signalwegen in Neuronen verknüpft und ist daher relevant für die Untersuchung von Mechanismen, die der Biologie neuroentwicklungsbedingter und neuropsychiatrischer Erkrankungen zugrunde liegen. Störungen der von NEUROD6 regulierten Transkription können neuronale Identität und Konnektivität verändern, was seinen Einsatz zur Modellierung von Genregulationsnetzwerken in humanen neuralen Zellen unterstützt.

MATH-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NEUROD6-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MATH-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NEUROD6-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NEUROD6-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MATH-2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NEUROD6-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MATH-2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MATH-2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NEUROD6-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.