Lsh Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402466-ACT

HELLS umano codifica per la lymphoid-specific helicase (Lsh), un rimodellatore della cromatina ATP-dipendente della famiglia SNF2 che coopera con le DNA metiltransferasi per instaurare e mantenere la metilazione del DNA e l’organizzazione dell’eterocromatina. Lsh sostiene l’assemblaggio della cromatina accoppiato alla replicazione, il silenziamento delle ripetizioni pericentromeriche e la stabilità del genoma regolando il posizionamento dei nucleosomi e la struttura della cromatina di ordine superiore. Attraverso queste funzioni epigenetiche, HELLS influenza programmi trascrizionali che controllano la progressione del ciclo cellulare e la differenziazione, e la sua disregolazione è associata a paesaggi di metilazione alterati e a fenotipi di instabilità genomica osservati in molteplici contesti patologici. HELLS è quindi ampiamente studiato nelle vie che governano l’ereditarietà epigenetica, la repressione dei trasposoni e il rimodellamento della cromatina legato alla riparazione del DNA.

Lsh Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HELLS senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Lsh Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HELLS nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HELLS, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Lsh. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HELLS nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Lsh nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Lsh nelle cellule tumorali con espressione di HELLS silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.