LRRK2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-426167-ACT

A quinase 2 rica em repetições de leucina (LRRK2) é uma grande quinase serina/treonina e GTPase multidomínio que coordena o tráfego vesicular, a homeostase endolisossomal, a dinâmica do citoesqueleto e a autofagia por meio de interações com GTPases Rab e redes de sinalização associadas. Em células de camundongo, a atividade de Lrrk2 influencia a remodelação, dependente de fosforilação, das vias de tráfego de membranas, conectando respostas imunes inatas e o controle de qualidade mitocondrial à adaptação celular ao estresse. A sinalização desregulada de LRRK2 tem sido amplamente estudada em mecanismos associados à neurodegeneração, incluindo proteostase alterada, função lisossomal comprometida e sinalização inflamatória aberrante. Essas características tornam a Lrrk2 um nó útil para dissecar a comunicação cruzada entre vias de manutenção neuronal, ativação glial e transporte intracelular.

LRRK2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Lrrk2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

LRRK2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Lrrk2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Lrrk2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de LRRK2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Lrrk2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de LRRK2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via LRRK2 em células tumorais com expressão de Lrrk2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.