LKB1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400313-ACT

STK11 kodiert die Serin/Threonin-Kinase LKB1, einen zentralen Regulator der zellulären Energieerkennung, der AMPK sowie eine Familie AMPK-verwandter Kinasen phosphoryliert und aktiviert. Über diese Substrate koordiniert LKB1 die metabolische Homöostase, die Zellpolarität, die Autophagie und Stressantworten und integriert Signale, die die Aktivität von mTORC1 und den Fortschritt des Zellzyklus beeinflussen. Der Verlust oder die Abschwächung der LKB1-Signalübertragung stört die epitheliale Organisation und metabolische Kontrollpunkte und verbindet eine STK11-Fehlfunktion mit der Tumorsuppressor-Biologie und einer veränderten Wachstumskontrolle in verschiedenen Geweben. Entsprechend wird STK11/LKB1 intensiv in Signalwegen untersucht, die die Nährstoffanpassung, die Mitochondrienfunktion und polaritätsabhängige Signalübertragung steuern.

LKB1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen STK11-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

LKB1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des STK11-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der STK11-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen LKB1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native STK11-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von LKB1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des LKB1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem STK11-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.