LIMK-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401057-ACT

LIMK1 kodiert LIMK‑1, eine Serin/Threonin-Kinase, die Cofilin phosphoryliert und dadurch inaktiviert, um den Umsatz von Aktinfilamenten und den Umbau des Zytoskeletts zu regulieren. Über Signale von Rho‑Familien-GTPasen via ROCK- und PAK-Signalwege koordiniert LIMK‑1 Veränderungen der Zellform, Adhäsionsdynamik und Zellbeweglichkeit und beeinflusst damit Prozesse wie Neuritenauswachsung und synaptische Plastizität. Eine fehlregulierte LIMK‑1-Aktivität wurde mit veränderter Aktindynamik in Modellen der Invasion und Metastasierung von Krebszellen sowie mit neuroentwicklungsbezogenen und kognitiven Phänotypen in Verbindung gebracht. Als Effektor des Aktin-Remodelings wird LIMK‑1 häufig in Signalwegen untersucht, die Migration, Mechanotransduktion und die Bildung von Stressfasern steuern.

LIMK-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen LIMK1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

LIMK-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des LIMK1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der LIMK1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen LIMK-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native LIMK1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von LIMK-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des LIMK-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem LIMK1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.