LDH-A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400403-ACT

Das humane **LDHA**-Gen kodiert die Laktatdehydrogenase A (LDH‑A), ein zytosolisches Enzym, das die wechselseitige Umwandlung von Pyruvat und Laktat katalysiert und dabei gleichzeitig NADH/NAD⁺ recycelt, wodurch der glykolytische Fluss unter aeroben und hypoxischen Bedingungen unterstützt wird. LDH‑A ist ein zentraler Knotenpunkt im Glukosestoffwechsel und in der Redoxhomöostase und beeinflusst metabolische Umprogrammierungen, die mit hoher Proliferationsrate und Hypoxie im Mikromilieu einhergehen. Eine veränderte LDHA‑Aktivität wurde mit Änderungen der Laktatproduktion, der intrazellulären pH‑Balance und der Aufteilung von Kohlenstoff zwischen Glykolyse und mitochondrialer Oxidation in Verbindung gebracht, was sie für Studien zur metabolischen Regulation in der Krebsbiologie und anderen Erkrankungen mit dysreguliertem Energiestoffwechsel relevant macht.

LDH-A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen LDHA-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

LDH-A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des LDHA-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der LDHA-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen LDH-A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native LDHA-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von LDH-A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des LDH-A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem LDHA-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.