Klotho CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400970-ACT

KL kodiert Klotho, ein Typ‑I‑Membranprotein, das als obligater Korezeptor für die endokrine FGF‑Signalübertragung fungiert, insbesondere für FGF23, und so die Homöostase von Phosphat und Vitamin D reguliert. Membrangebundenes Klotho moduliert außerdem mehrere Signalwege, darunter Insulin/IGF‑1, Wnt/β‑Catenin und TGF‑β, und beeinflusst dadurch Reaktionen auf oxidativen Stress, zelluläre Seneszenz sowie den Umbau der extrazellulären Matrix. Eine durch Shedding gebildete lösliche Klotho‑Ektodomäne kann parakrin/endokrin wirken und in verschiedenen Geweben die Aktivität von Ionenkanälen und die Wachstumsfaktor‑Signalgebung beeinflussen. Eine dysregulierte KL‑Expression wurde mit altersassoziierten Phänotypen in Verbindung gebracht und in Zusammenhängen wie chronischer Nierenerkrankung, kardiovaskulärem Remodeling, metabolischer Dysfunktion und Neurodegeneration untersucht – als mechanistische Verbindung zwischen Mineralstoffwechsel und Gewebehomöostase.

Klotho Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KL-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Klotho Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KL-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KL-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Klotho-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KL-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Klotho-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Klotho-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KL-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.