KiSS-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402710-ACT

O gene humano KISS1 codifica o precursor peptídico KiSS-1, que é processado proteoliticamente em kisspeptinas, ligantes secretados do receptor KISS1R (GPR54), um receptor acoplado à proteína G. A sinalização kisspeptina–KISS1R ativa a mobilização de cálcio dependente de PLC/PKC e as vias de MAPK, integrando o controlo neuroendócrino da libertação da hormona libertadora de gonadotrofinas (GnRH) e a regulação mais ampla do eixo reprodutivo. Para além da função endócrina, o KISS1 tem sido associado à regulação da migração e da invasão celular, com efeitos dependentes do contexto sobre o comportamento metastático em diferentes modelos tumorais. Alterações na sinalização KISS1/KISS1R têm sido associadas a perturbações reprodutivas e à biologia do cancro, tornando-a um nó útil para estudar a sinalização ligante–recetor e a regulação transcricional.

KiSS-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de KISS1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

KiSS-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus KISS1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição KISS1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de KiSS-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus KISS1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de KiSS-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via KiSS-1 em células tumorais com expressão de KISS1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.