ITPase CRISPR Activation Plasmid (m): sc-421191-ACT

Das murine Itpa-Gen kodiert die Inosintriphosphat-Pyrophosphatase (ITPase), ein zytosolisches „Housekeeping“-Enzym, das nichtkanonische Purintriphosphate wie ITP und dITP hydrolysiert, um deren Anreicherung zu verhindern. Durch die „Sanitisierung“ des Nukleotidpools unterstützt die ITPase die Replikationstreue, die DNA-/RNA-Integrität sowie Prozesse der Genomstabilität, die eng mit zellulären Stressantworten verknüpft sind. Eine Störung der Homöostase des Nukleotidpools kann die Fehlinkorporation erhöhen und die DNA-Schadenssignalgebung verstärken, wodurch die ITPA-Funktion mit Signalwegen in Verbindung steht, die Mutagenese und entzündliche Signalkaskaden beeinflussen. Eine veränderte ITPA-Aktivität ist daher in Mausmodellen für genomische Instabilität und stoffwechselassoziierte Phänotypen relevant.

ITPase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Itpa-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ITPase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Itpa-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Itpa-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ITPase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Itpa-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ITPase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ITPase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Itpa-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.