Plásmido CRISPR de Activación (m) IDO: sc-421024-ACT

El gen Ido1 de ratón codifica la indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO), una enzima dependiente de hemo que cataliza el primer paso y el paso limitante de la velocidad del catabolismo del triptófano a través de la vía de la quinurenina. Al regular la disponibilidad local de triptófano y generar metabolitos bioactivos de la quinurenina, IDO influye en la activación de células inmunitarias, la presentación de antígenos y los programas de señalización inflamatoria, incluidas vías vinculadas a la actividad del receptor de hidrocarburos arílicos (AHR) y a las respuestas de estrés celular. La expresión de Ido1 suele inducirse por interferón-γ y otras señales inflamatorias, lo que la conecta con mecanismos de tolerancia inmunitaria y homeostasis tisular. La actividad desregulada de IDO se ha asociado con la evasión inmunitaria tumoral, la inflamación asociada a infecciones crónicas, la regulación inmunitaria relacionada con la autoinmunidad y procesos neuroinflamatorios, lo que la convierte en un nodo útil para la investigación en inmunometabolismo.

IDO El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Ido1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

IDO El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Ido1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Ido1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de IDO. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Ido1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de IDO en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía IDO en células tumorales con expresión de Ido1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.