Plasmide CRISPR/Cas9 KO Hint1 (h): sc-418276

Présentation

HINT1 (histidine triad nucleotide-binding protein 1) code Hint1, une hydrolase de nucléotides de la famille HIT exprimée de manière ubiquitaire, qui régule l’homéostasie des protéines et des nucléotides par hydrolyse de substrats comportant une liaison phosphoramidate. Hint1 a été impliquée dans la signalisation et le contrôle transcriptionnel en modulant ses interactions avec des protéines régulatrices, influençant les réponses cellulaires au stress, l’apoptose et les voies de maintenance du génome. En biologie humaine, la fonction de HINT1 est liée au contrôle des programmes de prolifération et de différenciation, et une expression ou une activité altérée a été associée à des phénotypes de neurodéveloppement et de neuropathie, ainsi qu’à des signatures moléculaires liées au cancer. Ces caractéristiques font de HINT1 un nœud d’intérêt pour étudier la régulation, médiée par des enzymes, des réseaux de signalisation, de la protéostase et de la viabilité cellulaire en conditions de stress.

Le Hint1 CRISPR/Cas9 KO Plasmid (h) est un ensemble de plasmides conçus pour la disruption ciblée du gène HINT1 dans les lignées cellulaires human. Chaque plasmide du pool co-exprime un sgRNA unique, ciblant un site distinct au sein du locus HINT1, ainsi que la nucléase Cas9 de Streptococcus pyogenes, et code pour la GFP afin de permettre l'identification par fluorescence et l'enrichissement des cellules transfectées avec succès. Cette stratégie multi-guide augmente la probabilité d'induire des décalages de cadre ou des délétions produisant un knock-out fonctionnel, offrant ainsi une alternative plus robuste aux approches à guide unique. Les cassures double brin (DSB) induites à plusieurs sites sont résolues par jonction non homologue (NHEJ) ou, lorsqu'elles sont utilisées avec le modèle donneur HDR inclus, par réparation dirigée par homologie (HDR) à un site cible défini au sein du locus.

Lorsqu'il est utilisé en conjonction avec le donneur HDR exprimant la RFP, les fluorescences GFP et RFP peuvent être utilisées conjointement pour distinguer les populations de cellules transfectées de celles éditées, rationalisant ainsi les workflows de tri par cytométrie en flux et de sélection de clones.

Donneur de réparation dirigée par homologie (HDR) — Cassette de puromycine avec rapporteur RFP

Pour les applications nécessitant des clones knock-out confirmés et sélectionnables, le Hint1 plasmide HDR (h) comprend une construction donneuse HDR contenant une cassette de résistance à la puromycine (PuroR) et un rapporteur protéine fluorescente rouge (RFP), flanquée de bras d'homologie spécifiques à un site cible HINT1 défini.
Lorsqu'il est co-transfecté avec le plasmide Hint1 CRISPR/Cas9 KO (h):

• La cassette PuroR-RFP s'intègre au site de coupure de Cas9 via HDR, perturbant le cadre de lecture ouvert HINT1.
  La fluorescence RFP fournit un indicateur visuel immédiat de la réussite de l'intégration, permettant l'identification ou le tri par fluorescence des cellules éditées avant ou parallèlement à la sélection par la puromycine.
  Les cellules éditées avec succès sont confirmées par leur résistance à la puromycine, ce qui réduit considérablement la charge de criblage des clones.
  Cette stratégie de sélection est idéale pour générer des lignées cellulaires KO clonales stables destinées à des études fonctionnelles en aval, au criblage de médicaments ou au développement de modèles.

Système de suppression de la cassette Cre-lox

La construction donneuse HDR comporte des sites loxP flanquant la cassette de sélection PuroR-RFP afin de permettre une suppression propre du marqueur après confirmation du clone. L'expression transitoire de la recombinase Cre via le vecteur Cre inclus Cre Vector: sc-418923 excise la cassette, laissant un site loxP résiduel minimal au sein du locus HINT1 et éliminant les effets de confusion potentiels sur les tests en aval.
Cette approche en deux étapes :

• Minimise la perturbation de l'architecture locale de la chromatine et des éléments régulateurs voisins
  Restaure un contexte génomique quasi-naturel au niveau du locus édité
  Permet la réutilisation de la stratégie de sélection à la puromycine dans la même lignée cellulaire pour des modifications supplémentaires

Caractéristiques principales

• gRNA ciblant le ou les exons HINT1 essentiels à la fonction Hint1
  Co-expression de SpCas9 et de sgRNA à partir d'un seul plasmide pour une administration simplifiée
  Donneur HDR avec résistance à la puromycine pour une sélection positive des clones
  Cassette PuroR flanquée de loxP avec vecteur de recombinase Cre pour une suppression transparente du marqueur
  Fourni prêt à l'emploi pour une administration par transfection

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.