HAX-1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-423888-ACT

Mouse Hax1 codiert für HAX-1, ein überwiegend mit Mitochondrien und dem endoplasmatischen Retikulum assoziiertes Protein, das das Zellüberleben reguliert, indem es Apoptose, die Calcium-Homöostase und Stressantworten moduliert. HAX-1 wird mit der Kontrolle der Integrität der mitochondrialen Membran und der Integration von Signalwegen in Verbindung gebracht, die die Funktion von Leukozyten und die allgemeine Immunhomöostase beeinflussen. Durch Interaktionen mit Komponenten des Zytoskeletts und der Maschinerie des vesikulären Transports kann HAX-1 außerdem die Zellmigration und den intrazellulären Transport beeinflussen. Eine Dysregulation HAX-1-abhängiger Überlebensprogramme ist in Modellen hämatopoetischer Dysfunktion und Entzündung relevant und macht HAX-1 zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien von Stressadaptations-Signalwegen.

HAX-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Hax1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HAX-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Hax1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Hax1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HAX-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Hax1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HAX-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HAX-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Hax1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.