GTPBP9 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405643-ACT

Humanes OLA1 kodiert das Obg-like ATPase 1-Protein, auch als GTPBP9 bezeichnet, eine P-Loop-NTPase, die an der Regulation der Protein-Homöostase und zellulärer Stressantworten beteiligt ist. OLA1/GTPBP9 wird mit der Modulation translationsbezogener Prozesse und der chaperonassoziierten Qualitätskontrolle in Verbindung gebracht und trägt dazu bei, die Proteostase unter oxidativem und metabolischem Stress zu formen. Über diese Aktivitäten kann es Signalnetzwerke beeinflussen, die den Nährstoffstatus mit Proteinsynthese und -faltung koppeln, einschließlich Signalwegen, die mit integrierten Stressantworten überschneiden. Eine dysregulierte OLA1/GTPBP9-Expression wurde in mehreren Krankheitskontexten beschrieben, was seine Eignung als Forschungsziel zur Untersuchung stressadaptiver Phänotypen, Proliferation und Proteomerhaltung in humanen Zellen unterstreicht.

GTPBP9 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen OLA1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GTPBP9 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des OLA1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der OLA1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GTPBP9-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native OLA1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GTPBP9-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GTPBP9-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem OLA1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.