GRK 3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403415-ACT

Humanes GRK3 (G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinase 3, ADRBK2) ist eine Serin/Threonin-Kinase, die aktivierte GPCRs phosphoryliert, um die Rekrutierung von β-Arrestin, die Desensibilisierung des Rezeptors und den endozytotischen Transport zu fördern. Indem GRK3 Amplitude und Dauer von GPCR-Signalen formt, beeinflusst es nachgeschaltete Signalwege einschließlich cAMP/PKA-, PLC–PKC- und MAPK/ERK-Signalisierung, mit weitreichenden Effekten auf die zelluläre Responsivität gegenüber Hormonen, Neurotransmittern und Chemokinen. Eine veränderte GRK3-Expression oder -Aktivität wurde mit fehlregulierten Rezeptor-Signalprogrammen in Verbindung gebracht, die für Entzündungsregulation, neuronale Signalübertragung und onkogene Phänotypen relevant sind, was GRK3 zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Analyse der Kontrolle von GPCR-Signalwegen macht. Studien zu GRK3 konzentrieren sich häufig auf rezeptorspezifischen Bias, Feedback-Regulation und das Cross-Talk zwischen G-Protein- und β-Arrestin-vermittelter Signalübertragung.

GRK 3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GRK3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GRK 3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GRK3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GRK3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GRK 3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GRK3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GRK 3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GRK 3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GRK3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.