GNPDA2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-417433-ACT

Humanes GNPDA2 (Glucosamin-6-phosphat-Deaminase 2) kodiert ein zytosolisches Enzym, das die reversible Umwandlung von Glucosamin-6-phosphat in Fructose-6-phosphat und Ammoniak katalysiert und damit den Hexosamin-Biosyntheseweg mit dem zentralen glykolytischen Stofffluss verknüpft. Durch die Modulation der Verfügbarkeit von UDP-GlcNAc für die N- und O-gebundene Proteinglykosylierung kann GNPDA2 die Nährstoffsensorik, die Proteostase sowie Signalprozesse beeinflussen, die von glykanvermittelter Regulation abhängen. Genetische und funktionelle Studien haben GNPDA2 mit metabolischen Phänotypen, darunter Body-Mass-Index und Adipositasrisiko, in Verbindung gebracht und damit seine Relevanz für Signalwege unterstrichen, die die Energiehomöostase und den insulinresponsiven Stoffwechsel steuern. Diese Eigenschaften machen GNPDA2 zu einem nützlichen Ziel, um in humanen Modellsystemen zu untersuchen, wie die Dynamik des Hexosaminwegs Zellwachstum, Stressantworten und metabolische Umprogrammierung beeinflusst.

GNPDA2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GNPDA2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GNPDA2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GNPDA2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GNPDA2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GNPDA2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GNPDA2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GNPDA2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GNPDA2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GNPDA2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.