GMF-γ CRISPR Activation Plasmid (m): sc-425658-ACT

Gmfg kodiert den Glia-Maturation-Factor Gamma (GMF-γ), ein in hämatopoetischen Zellen angereichertes, aktinregulierendes Protein, das den zytoskelettalen Umbau, Veränderungen der Zellform und die gerichtete Migration moduliert. GMF-γ beeinflusst die Arp2/3-abhängige Aktindynamik und ist an Prozessen wie Leukozyten-Chemotaxis, Adhäsion sowie Signalereignissen beteiligt, die das Trafficking entzündlicher und immunologischer Zellen koordinieren. In Mausmodellen und primären Immunzellen wurde eine veränderte GMF-γ-Aktivität mit einer Fehlregulation des Verhaltens myeloider und lymphoider Zellen in Verbindung gebracht, was GMF-γ für die Untersuchung von Signalwegen relevant macht, die Entzündung und immunvermittelte Gewebereaktionen zugrunde liegen. Diese Eigenschaften machen GMF-γ zu einem nützlichen Ansatzpunkt, um migrationsassoziierte Signalgebung und die Homöostase von Aktinnetzwerken in der biomedizinischen Forschung zu analysieren.

GMF-γ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Gmfg-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GMF-γ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Gmfg-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Gmfg-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GMF-γ-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Gmfg-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GMF-γ-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GMF-γ-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Gmfg-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.