GLCNE CRISPR Activation Plasmid (m): sc-424509-ACT

Das murine Gen **Gne** kodiert die Glucosamin-(UDP-N-acetyl)-2-Epimerase/N-Acetylmannosamin-Kinase (GLCNE), ein bifunktionales, geschwindigkeitsbestimmendes Enzym im de-novo-Biosyntheseweg der Sialinsäure, das UDP-GlcNAc in ManNAc-6-phosphat umwandelt. Durch die Kontrolle zellulärer CMP-Sialinsäure-Pools beeinflusst GLCNE die Sialylierung von Proteinen und Lipiden, die die Reifung von Glykoproteinen im sekretorischen Weg prägt und die Zell-Zell-Erkennung, Adhäsion sowie Rezeptorsignalisierung an der Plasmamembran moduliert. Veränderte Gne-Aktivität und eine gestörte Sialylierungs-Homöostase stehen mit Defekten der Muskelphysiologie sowie breiteren, glykosylierungsassoziierten Stressantworten in Zusammenhang, die inflammatorische Signalwege und Interaktionen mit der extrazellulären Matrix beeinflussen. Diese biologischen Eigenschaften machen **Gne** zu einem nützlichen Ziel, um in Mausmodellsystemen die sialylierungsabhängige Regulation von Membranproteinen, den Transport (Trafficking) und die Zusammensetzung von Glykokonjugaten zu untersuchen.

GLCNE Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Gne-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GLCNE Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Gne-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Gne-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GLCNE-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Gne-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GLCNE-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GLCNE-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Gne-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.