GLCNE CRISPR Activation Plasmid (h): sc-406100-ACT

Das humane GNE-Gen kodiert die bifunktionelle UDP-GlcNAc-2-Epimerase/N-Acetylmannosamin-Kinase (GLCNE), die die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte der Sialinsäurebiosynthese katalysiert, indem sie UDP-GlcNAc zu ManNAc umwandelt und ManNAc zu ManNAc-6-phosphat phosphoryliert. Über die Kontrolle der CMP-Sialinsäure-Produktion beeinflusst GLCNE die Sialylierung von Glykoproteinen und Glykolipiden und wirkt sich damit auf Zell-Zell-Interaktionen, Rezeptorsignalgebung und die Stabilität von Membranproteinen aus. Dieser metabolische Knotenpunkt ist in Hexosamin- und Nukleotidzucker-Stoffwechselwege eingebunden, die das Remodeling von Glycokonjugaten während der Entwicklung und in immunbezogenen Prozessen prägen. Pathogene Varianten in GNE sind mit der GNE-Myopathie assoziiert und wurden zudem mit einer weiter gefassten Dysregulation glykosylierungsabhängiger zellulärer Phänotypen in Verbindung gebracht, die für die neuromuskuläre Biologie und die Glykobiologie-Forschung relevant sind.

GLCNE Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GNE-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GLCNE Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GNE-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GNE-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GLCNE-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GNE-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GLCNE-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GLCNE-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GNE-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.