Plásmido CRISPR de Activación (h) GIT1: sc-402136-ACT

La GIT1 humana (G protein-coupled receptor kinase–interacting protein 1) es un andamiaje asociado a proteínas activadoras de GTPasa de ARF que coordina el recambio de las adhesiones focales, el tráfico de receptores y la remodelación del citoesqueleto de actina. Mediante interacciones con proteínas como las GRK, la paxilina y componentes de complejos endocíticos y de adhesión, GIT1 ayuda a integrar señales de los GPCR y de los receptores tirosina cinasa en vías que controlan la migración, la dinámica de los lamelipodios y la organización sináptica/neuronal. La señalización vinculada a GIT1 se ha estudiado en contextos como el comportamiento celular invasivo, las respuestas angiogénicas y vasculares, y procesos del neurodesarrollo en los que la regulación de la adhesión y del citoesqueleto es clave. Por ello, la expresión desregulada o la conectividad alterada de la red de GIT1 resulta relevante para la investigación mecanística de la motilidad de células cancerosas, el entrecruzamiento de la señalización inflamatoria y fenotipos neurológicos.

GIT1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de GIT1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

GIT1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus GIT1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional GIT1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de GIT1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo GIT1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de GIT1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía GIT1 en células tumorales con expresión de GIT1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.