GCNT3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-411258-ACT

Humanes GCNT3 (Glucosaminyl-(N-acetyl)-Transferase 3) kodiert eine im Golgi-Apparat lokalisierte Glykosyltransferase, die O-Glykane verlängert, indem sie die Bildung von Core-2- und Core-4-Strukturen auf mucinartigen Glykoproteinen katalysiert. Durch die Umgestaltung der Glykanverzweigung beeinflusst GCNT3 die epitheliale Differenzierung, die Eigenschaften der mukosalen Barriere sowie Zell‑Zell- bzw. Zell‑Matrix-Interaktionen, die von der Erkennung von Glykoproteinen und Glykolipiden abhängen. Seine Aktivität greift in O‑Glykosylierungsnetzwerke ein, die Rezeptorstabilität, -transport (Trafficking) und Immunerkennung prägen, und verbindet GCNT3 mit Signalwegen, die Adhäsion und entzündliche Signalübertragung steuern. Veränderte GCNT3-Expression oder Glykosylierungsmuster wurden in mehreren epithelialen Krankheitskontexten beschrieben, darunter Krebserkrankungen, bei denen Änderungen von Mucin-Glykoformen Invasion, metastaseassoziierte Phänotypen und Interaktionen zwischen Tumor und Mikroumgebung beeinflussen können.

GCNT3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GCNT3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GCNT3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GCNT3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GCNT3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GCNT3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GCNT3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GCNT3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GCNT3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GCNT3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.