Plásmido CRISPR de Activación (h) GCKR: sc-401623-ACT

El GCKR humano codifica la proteína reguladora de la glucocinasa, un modulador del aprovechamiento de la glucosa enriquecido en hepatocitos que se une a la glucocinasa y la secuestra para ajustar el flujo glucolítico en respuesta al estado de nutrientes y fosfatos. Al regular la disponibilidad de glucocinasa, GCKR influye en la detección hepática de glucosa, la síntesis de glucógeno y el equilibrio entre la glucólisis y la lipogénesis de novo, integrando el metabolismo de los carbohidratos con la producción de triglicéridos. La variación genética o la expresión alterada de GCKR se han asociado con cambios en la glucosa en ayunas, la sensibilidad a la insulina y rasgos lipídicos circulantes, lo que lo hace relevante para la biología de las enfermedades metabólicas. En modelos basados en células, la perturbación de GCKR ofrece una forma manejable de investigar el cableado de las vías metabólicas hepáticas y los programas transcripcionales sensibles a los nutrientes.

GCKR El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de GCKR sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

GCKR El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus GCKR en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional GCKR, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de GCKR. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo GCKR y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de GCKR en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía GCKR en células tumorales con expresión de GCKR silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.