GAPDH CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400163-ACT

Das humane Gen **GAPDHS** kodiert eine spermiumspezifische Isoform der Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH-Familie), die einen Schlüsselschritt der Glykolyse katalysiert, indem sie Glycerinaldehyd-3-phosphat zu 1,3-Bisphosphoglycerat umsetzt und dabei gleichzeitig NADH erzeugt. **GAPDHS** wird in männlichen Keimzellen stark exprimiert und unterstützt den für Spermienreifung und -motilität erforderlichen Energiestoffwechsel; damit ist es mit dem glykolytischen Fluss, der Redoxhomöostase und der ATP-Generierung im Flagellum verknüpft. Eine Fehlregulation oder genetische Variation von **GAPDHS** wurde mit eingeschränkter Spermienfunktion und infertilitätsassoziierten Phänotypen in Verbindung gebracht, was das Gen für Studien zur Reproduktionsbiologie, zur metabolischen Kompartimentierung und zur Koordination zwischen Mitochondrien und Glykolyse relevant macht. Als Enzym der GAPDH-Familie dient es zudem als nützlicher Ansatzpunkt, um zu untersuchen, wie glykolytische Enzyme zu spezialisierten zellulären Programmen jenseits des „Housekeeping“-Stoffwechsels beitragen.

GAPDH-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GAPDHS-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GAPDH-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GAPDHS-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GAPDHS-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GAPDH-2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GAPDHS-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GAPDH-2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GAPDH-2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GAPDHS-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.