Ganglioside sialidase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404848-ACT

NEU3 kodiert eine mit der menschlichen Plasmamembran assoziierte Gangliosid-Sialidase, die terminale Sialinsäuren von Gangliosiden und verwandten Glycosphingolipiden entfernt und dadurch die Zusammensetzung der Glycane an der Zelloberfläche verändert. Durch die Modulation gangliosidabhängiger Membran-Mikrodomänen kann NEU3 die Signalübertragung von Rezeptor-Tyrosinkinasen, Zelladhäsion und -migration sowie nachgeschaltete, mit MAPK/PI3K verknüpfte Signalwege beeinflussen, die auf Veränderungen der Lipid-Protein-Organisation reagieren. Eine veränderte Sialidase-Aktivität wirkt sich auf den Glycosphingolipid-Stoffwechsel und inflammatorische Signalnetzwerke aus, wodurch NEU3 ein nützlicher Knotenpunkt ist, um zu untersuchen, wie Glycan-Remodeling die Zellkommunikation reguliert. Eine dysregulierte NEU3-Expression wurde im Kontext aberranten Wachstums und von Gewebeumbau beschrieben, was ihre Relevanz für mechanistische Studien zu krankheitsassoziierter Signalübertragung und Membranbiologie unterstreicht.

Ganglioside sialidase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NEU3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Ganglioside sialidase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NEU3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NEU3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Ganglioside sialidase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NEU3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Ganglioside sialidase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Ganglioside sialidase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NEU3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.