GADD 34 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400595-ACT

PPP1R15A kodiert GADD34, eine regulatorische Untereinheit der Proteinphosphatase 1, die die Dephosphorylierung von eIF2α fördert, um die integrierte Stressantwort (ISR) zu beenden und nach zellulärem Stress die globale Proteinsynthese wiederherzustellen. Als nachgeschaltetes Ziel der ATF4/CHOP-Signalgebung induziert, fungiert GADD34 als zentraler Feedback-Knoten in ER-Stress- und Unfolded-Protein-Response(UPR)-Signalwegen und beeinflusst damit Proteostase, die Empfindlichkeit gegenüber Apoptose sowie die Erholung von einem translationsbedingten Arrest. Aufgrund seines Einflusses auf stressadaptive Signalgebung wird PPP1R15A u. a. im Kontext von Entzündung, metabolischem Stress, Neurodegeneration und dem Überleben von Tumorzellen untersucht, wo fehlregulierte Stressantworten zu Krankheitsphänotypen beitragen können. Seine Aktivität überschneidet sich zudem mit Programmen, die mit oxidativem Stress und DNA-Schäden assoziiert sind, was es zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Untersuchungen von Stress-Signalnetzwerken macht.

GADD 34 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PPP1R15A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GADD 34 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PPP1R15A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PPP1R15A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GADD 34-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PPP1R15A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GADD 34-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GADD 34-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PPP1R15A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.