Plásmido CRISPR de Activación (h) G6PD: sc-401019-ACT

El gen humano G6PD codifica la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, la enzima limitante de la vía oxidativa de las pentosas fosfato, que genera NADPH para la biosíntesis reductora y la defensa antioxidante. Al mantener el ciclo redox del glutatión y proteger frente a las especies reactivas de oxígeno, G6PD favorece las respuestas celulares al estrés oxidativo y metabólico, en particular en los eritrocitos y otros entornos con alta carga oxidante. La actividad de G6PD influye en la biosíntesis de nucleótidos mediante la producción de ribosa-5-fosfato e interactúa con vías que regulan la proliferación, la inflamación y la sensibilidad a la ferroptosis. Las alteraciones genéticas o funcionales de G6PD se asocian con susceptibilidad a la hemólisis ante desafíos oxidativos y se estudian ampliamente por su impacto en la homeostasis redox en diversos contextos relevantes para enfermedades.

G6PD El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de G6PD sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

G6PD El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus G6PD en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional G6PD, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de G6PD. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo G6PD y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de G6PD en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía G6PD en células tumorales con expresión de G6PD silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.