G3PP/PGP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402332-ACT

Humanes PGP, auch bekannt als G3PP (Glycerol-3-phosphat-Phosphatase), kodiert eine zytosolische Phosphatase, die Glycerol-3-phosphat zu Glycerol hydrolysiert und damit den Glycerolipidstoffwechsel mit dem glykolytischen Fluss und der Redox-Homöostase verknüpft. Durch die Modulation der Verfügbarkeit von Glycerol-3-phosphat beeinflusst G3PP/PGP die Triglyceridsynthese, den Glycerolphosphat-Shuttle und die mitochondriale Reoxidation von NADH und prägt so zelluläre Antworten auf Nährstoffüberschuss und oxidativen Stress. Diese metabolische Kontrolle ist relevant für Studien zur Insulinsekretion und -sensitivität, Lipotoxizität und Energiebilanz in Leber, Fettgewebe, Skelettmuskel und pankreatischen Betazellen. Eine fehlregulierte Verarbeitung von Glycerolipiden und der mit der G3PP/PGP-Aktivität verbundene Redoxdruck werden häufig im Kontext des metabolischen Syndroms, adipositasassoziierter Entzündung und diabetesbedingter zellulärer Dysfunktion untersucht.

G3PP/PGP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PGP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

G3PP/PGP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PGP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PGP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen G3PP/PGP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PGP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von G3PP/PGP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des G3PP/PGP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PGP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.