frizzled-7 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401590-ACT

FZD7 kodiert Frizzled-7, einen siebenfach die Zellmembran durchspannenden Rezeptor, der WNT-Liganden bindet und dadurch die kanonische β‑Catenin-Signalübertragung sowie die nicht-kanonischen Signalwege der planaren Zellpolarität und des WNT/Ca²⁺-Signalwegs initiiert. Über eine Dishevelled-abhängige Signaltransduktion beeinflusst FZD7 Zellschicksalsentscheidungen, Polarität, Migration und stammzellähnliche Phänotypen und integriert dabei Signale während der Entwicklung und der Gewebehomöostase. Eine fehlregulierte FZD7/WNT-Signalgebung ist in zahlreichen Malignomen häufig mit onkogenen Transkriptionsprogrammen, epithelial–mesenchymaler Transition und veränderten Differenzierungszuständen assoziiert. Da FZD7 auf Ebene des Rezeptors bei der Aktivierung des WNT-Signalwegs ansetzt, wird es breit untersucht, um seinen Beitrag zu kontextabhängigen Signalausgängen und zum Pathway-Cross-talk zu verstehen.

frizzled-7 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FZD7-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

frizzled-7 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FZD7-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FZD7-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen frizzled-7-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FZD7-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von frizzled-7-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des frizzled-7-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FZD7-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.