Plasmide CRISPR d'Activation (h) Fibulin-4: sc-404037-ACT

EFEMP2 code la fibuline‑4, une glycoprotéine sécrétée de la matrice extracellulaire qui s’intègre aux microfibrilles des fibres élastiques et soutient l’élastogenèse grâce à ses interactions avec la tropoélastine, les fibrillines et la machinerie de réticulation dépendante de la lysyl‑oxydase. La fibuline‑4 contribue à l’organisation de la matrice extracellulaire, à la mécanotransduction et à l’intégrité de la paroi vasculaire, en influençant le remodelage du tissu conjonctif et l’homéostasie des cellules musculaires lisses. Une expression altérée d’EFEMP2 ou un dysfonctionnement de la fibuline‑4 est associé à une perturbation de l’assemblage des fibres élastiques et à des défauts de matrice extracellulaire liés à des phénotypes héréditaires du tissu conjonctif et vasculaires. Ces fonctions centrées sur la biologie et la matrice font d’EFEMP2 un nœud pertinent pour étudier les voies des fibres élastiques, la protéostasie de la MEC et la signalisation cellule–matrice dans des systèmes modèles humains.

Fibulin-4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EFEMP2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Fibulin-4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EFEMP2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EFEMP2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Fibulin-4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EFEMP2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Fibulin-4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Fibulin-4 dans les cellules tumorales présentant une expression de EFEMP2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.