Plásmido CRISPR de Activación (m) Fibulin-3: sc-432105-ACT

Efemp1 codifica la fibulina‑3, una glucoproteína de la matriz extracelular que se integra en las microfibrillas asociadas a las fibras elásticas y modula el ensamblaje y la estabilidad de la matriz. En tejidos de ratón, la fibulina‑3 influye en la adhesión célula‑matriz, la migración y la remodelación tisular al moldear la organización de la matriz extracelular y la actividad de proteasas, con efectos posteriores sobre vías vinculadas con la fibrosis, la angiogénesis y la señalización inflamatoria. Las alteraciones en los niveles de fibulina‑3 se han asociado con fenotipos del tejido conectivo y de la retina, y se estudian con frecuencia en el contexto de la desregulación de la matriz, incluida la remodelación del microambiente tumoral y los procesos degenerativos relacionados con la edad. Por lo tanto, Efemp1 sirve como un locus abordable para explorar cómo la composición de la matriz extracelular controla la mecanobiología y los programas de respuesta al estrés.

Fibulin-3 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Efemp1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Fibulin-3 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Efemp1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Efemp1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Fibulin-3. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Efemp1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Fibulin-3 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Fibulin-3 en células tumorales con expresión de Efemp1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.