FEN-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403168-ACT

Das menschliche FEN1-Gen kodiert die Flap-Endonuklease 1 (FEN-1), eine struktur­spezifische Nuklease, die für die Verarbeitung von 5′-Flap-Zwischenprodukten während der Reifung der Okazaki-Fragmente und der Long-Patch-Basenexzisionsreparatur essenziell ist. FEN-1 arbeitet mit PCNA, DNA-Polymerase δ/ε und DNA-Ligase I zusammen, um die Progression der Replikationsgabel und die Genomintegrität aufrechtzuerhalten, und trägt zur Telomerstabilität sowie zur Auflösung blockierter Replikationsstrukturen bei. Eine dysregulierte FEN1-Aktivität oder -Expression wird mit Replikationsstress, chromosomaler Instabilität und veränderter Signalgebung der DNA-Schadensantwort in Verbindung gebracht, wodurch FEN-1 für Untersuchungen zu Mutagenese und krebsassoziierten Defekten der Genomwartung relevant ist. Als zentraler Knotenpunkt in DNA-Replikation und -Reparatur wird FEN-1 häufig in Signalwegen untersucht, die Zellzyklus-Checkpoints, die Wahl des Reparaturwegs und Resistenzmechanismen gegenüber genotoxischen Einwirkungen steuern.

FEN-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FEN1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FEN-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FEN1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FEN1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FEN-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FEN1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FEN-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FEN-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FEN1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.