FAT2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402931-ACT

Human FAT2 kodiert ein atypisches, Cadherin-ähnliches Protein der FAT-Familie, das an Zell-Zell-Adhäsion, planarer Zellpolarität und der Regulation der Zytoskelettorganisation beteiligt ist. FAT2-assoziierte Signalwege greifen in Prozesse ein, die die Epithelarchitektur, gerichtete Migration und Gewebemorphogenese prägen, und verknüpfen FAT2 mit Signalwegen der Polaritätsetablierung und der Integrität von Zellkontakten. Veränderte Aktivität von FAT-Familienmitgliedern wurde in mehreren Krankheitskontexten mit einer dysregulierten Wachstumskontrolle und invasiven Phänotypen in Verbindung gebracht, was die Untersuchung von FAT2 in der Mechanobiologie und der epithelialen Homöostase unterstützt. FAT2 ist daher relevant für Studien zu polaritätsabhängiger Signalübertragung, Membranorganisation und adhäsionsgekoppelten Transkriptionsprogrammen.

FAT2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FAT2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FAT2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FAT2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FAT2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FAT2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FAT2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FAT2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FAT2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FAT2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.