FAS-L Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400562-ACT

FASLG codifica il ligando Fas (FAS-L), un membro di tipo II transmembrana della superfamiglia del TNF che si lega al recettore Fas (CD95) per avviare la segnalazione apoptotica estrinseca. Il legame a Fas induce il reclutamento di FADD e l’attivazione della caspasi-8, con effetti a valle sulle cascate delle caspasi, sull’amplificazione mitocondriale e sull’omeostasi immunitaria. FAS-L è un regolatore chiave della morte cellulare indotta dall’attivazione nei linfociti T e contribuisce alla tolleranza periferica e alla funzione effettrice dei linfociti citotossici. Una deregolazione della segnalazione FASLG/Fas è stata associata a patologie immuno-mediate, fenotipi linfoproliferativi e meccanismi di evasione immunitaria tumorale, rendendola rilevante per studi su infiammazione, autoimmunità e biologia del cancro.

FAS-L Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FASLG senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FAS-L Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FASLG nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FASLG, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FAS-L. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FASLG nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FAS-L nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FAS-L nelle cellule tumorali con espressione di FASLG silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.