Particules Lentivirales d'Activation (h) FANCD2: sc-400445-LAC

FANCD2 code un effecteur central de la voie de réparation des pontages interbrins de l’ADN (ICL) de l’anémie de Fanconi (FA) et coordonne le maintien du génome pendant la phase S. En cas de stress de réplication ou de lésions de type pontage, FANCD2 est monoubiquitinée et s’accumule aux fourches de réplication bloquées, où elle sert de plateforme à la réparation avec des partenaires incluant FANCI, BRCA1/2, RAD51 et des nucléases qui traitent les lésions de l’ADN. Cette activité s’articule avec la recombinaison homologue, la signalisation des points de contrôle et la protection des fourches de réplication, reliant la fonction de FANCD2 à la stabilité chromosomique et à la progression du cycle cellulaire. Des défauts de la réparation médiée par FANCD2 sont associés aux phénotypes d’anémie de Fanconi et à une sensibilité accrue aux agents pontants, faisant de cette voie une cible majeure des études sur les réponses aux dommages de l’ADN et l’instabilité génomique associée au cancer.

Les particules d'activation lentivirales FANCD2 (h) répondent à ce besoin en encapsulant le système complet d'activation transcriptionnelle SAM (Synergistic Activation Mediator) dans des particules lentivirales à titre élevé prêtes à la transduction, permettant une régulation à la hausse efficace de FANCD2 dans un plus large éventail de types de cellules humaines.

Les particules d'activation lentivirales FANCD2 (h) délivrent tous les composants fonctionnels du système médiateur d'activation synergique (SAM) via la transduction lentivirale. Le système comprend trois préparations de particules co-transduites dans les cellules cibles : l'une codant pour une dCas9 catalytiquement inactive (mutations D10A et N863A) fusionnée au domaine de transactivation VP64 avec un gène de résistance à la blasticidine ; une codant pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1 avec un gène de résistance à l'hygromycine ; et une codant pour un ARNsg de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 avec un gène de résistance à la puromycine. Après transduction lentivirale et intégration génomique des cassettes d'expression, les composants du SAM sont exprimés de manière stable et s'assemblent au locus cible dans la région promotrice proximale en amont du site de départ de la transcription FANCD2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de manière coopérative pour recruter l'appareil transcriptionnel endogène et induire une régulation à la hausse soutenue de l'expression endogène de FANCD2. L'utilisation de dCas9 inactif sur les nucléases évite l'introduction de cassures double brin de l'ADN et préserve le locus génomique natif FANCD2 ainsi que l'architecture régulatrice.

Le format lentiviral offre plusieurs avantages pratiques : l'intégration génomique stable permet une activation héréditaire au fil des divisions cellulaires ; les préparations de particules à titre élevé éliminent le besoin d'une production virale en interne ; et la compatibilité avec les types de cellules primaires, non divisibles et résistantes à la transfection élargit l'accessibilité expérimentale. Le succès de la transduction peut être confirmé et renforcé par une triple sélection antibiotique utilisant la puromycine, l'hygromycine et la blasticidine.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.