FAM20A Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-431579-ACT

Fam20a codifica a FAM20A, uma proteína da via secretora localizada no aparelho de Golgi, que atua como uma pseudocinase e parceira reguladora da cinase FAM20C, influenciando a fosforilação de proteínas extracelulares e secretadas. Por meio desse papel, a FAM20A ajuda a coordenar o processamento proteico e programas relacionados à mineralização em tecidos associados ao esmalte e ao osso, conectando o tráfego no Golgi à maturação da matriz extracelular. A disrupção da atividade de FAM20A tem sido associada a defeitos na biomineralização e a fenótipos de calcificação ectópica, tornando-a relevante para estudos de biologia esquelética e desenvolvimento dentário. Em sistemas murinos, portanto, Fam20a é uma ferramenta útil para investigar como a via secretora controla a fosforilação de proteínas extracelulares e a homeostase da matriz.

FAM20A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Fam20a sem alterar a sequência de ADN subjacente.

FAM20A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Fam20a em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Fam20a, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de FAM20A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Fam20a nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de FAM20A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via FAM20A em células tumorais com expressão de Fam20a silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.