Epac CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401807-ACT

RAPGEF3 kodiert Epac (Exchange Protein Directly Activated by cAMP), einen Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor, der die cAMP-Signalübertragung mit der Aktivierung der kleinen GTPasen Rap1 und Rap2 verknüpft. Über die Rap-abhängige Kontrolle der Integrin-Affinität, der Stabilität von Zell-Zell-Kontakten und der Zytoskelettdynamik reguliert Epac Adhäsion, Migration, Barrierefunktion und Vesikeltransport in zahlreichen Zelltypen. Die Epac-Signalgebung überschneidet sich mit PKA-unabhängigen cAMP-Signalwegen und integriert sich in MAPK- und PI3K-Regulationsnetzwerke, um Proliferation und Stressantworten zu steuern. Eine Fehlregulation der RAPGEF3/Epac-Aktivität wurde mit Prozessen in Verbindung gebracht, die für Tumorzellinvasion, kardiovaskuläre und inflammatorische Phänotypen sowie die Stoffwechselkontrolle relevant sind, was RAPGEF3 zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Signalwegstudien macht.

Epac Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RAPGEF3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Epac Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RAPGEF3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RAPGEF3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Epac-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RAPGEF3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Epac-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Epac-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RAPGEF3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.