ELKS CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404216-ACT

Das humane Gen **ERC1** kodiert **ELKS** (auch bekannt als Rab6-interagierendes/CAST-Familien-Scaffold-Protein), einen zentralen Bestandteil der kortikalen aktiven Zone, der das Andocken von Vesikeln und die regulierte Exozytose organisiert. ELKS koordiniert Proteinkomplexe, die die Signalgebung kleiner GTPasen mit zytoskelettalen sowie Membrantransport- und Trafficking-Wegen koppeln, um eine effiziente Neurotransmitterfreisetzung und die Fusion sekretorischer Granula zu unterstützen. In Neuronen und endokrinen Zellen trägt ELKS durch Interaktionen mit Komponenten der aktiven Zone und SNARE-assoziierten Maschinerien zur synaptischen Organisation, zur präsynaptischen Freisetzungswahrscheinlichkeit und zur stimulusabhängigen Sekretion bei. Veränderte ERC1/ELKS-Expression oder -Lokalisation wurde mit einer dysregulierten synaptischen Transmission und weiter gefassten neurobiologischen Phänotypen in Verbindung gebracht, was seine Nutzung als molekularen Ansatzpunkt in pathway-orientierten Studien zu Sekretion und Schaltkreisfunktion unterstützt.

ELKS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ERC1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ELKS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ERC1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ERC1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ELKS-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ERC1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ELKS-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ELKS-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ERC1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.