eIF4B CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402494-ACT

Human EIF4B kodiert eIF4B, einen Initiationsfaktor der Translation, der die RNA-Helikaseaktivität von eIF4A verstärkt und die Rekrutierung des 43S-Präinitiationskomplexes an strukturierte mRNAs fördert, wodurch die Effizienz der cap-abhängigen Translation steigt. eIF4B wird durch Wachstumsfaktor- und Nährstoffsignalwege reguliert, darunter die PI3K–AKT–mTOR- und MAPK-Signalwege, über Phosphorylierungsereignisse, die das Ribosomen-Loading und die Proteinsyntheseraten feinjustieren. Durch die Beeinflussung der Translation von Transkripten, die an Proliferation, Stressantworten und Überleben beteiligt sind, trägt EIF4B zu zellulären Programmen wie der Zellzyklusprogression und der adaptiven translationalen Kontrolle bei. Eine dysregulierte eIF4B-Aktivität und -Phosphorylierung wurde mit einer veränderten translationalen Ausgabe in der Krebsbiologie und anderen Erkrankungen in Verbindung gebracht, bei denen die Kontrolle der Proteinsynthese gestört ist.

eIF4B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EIF4B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

eIF4B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EIF4B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EIF4B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen eIF4B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EIF4B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von eIF4B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des eIF4B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EIF4B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.