eIF2Bε CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403917-ACT

EIF2B5 kodiert die ε‑Untereinheit des eukaryotischen Initiationsfaktors 2B (eIF2Bε), den katalytischen Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor, der aktives eIF2–GTP regeneriert und so die cap‑abhängige Initiation der Translation aufrechterhält. eIF2Bε ist ein zentraler Knotenpunkt der integrierten Stressantwort (ISR), der die Phosphorylierung von eIF2α mit einer globalen Repression der Translation verknüpft und zugleich die selektive Translation stressadaptiver Transkripte ermöglicht. Über diese Regulation der Proteostase und der Dynamik von Stressgranula beeinflusst EIF2B5 die Homöostase von Neuronen und Gliazellen, Myelinisierungsprogramme sowie die zelluläre Widerstandsfähigkeit gegenüber metabolischem und oxidativem Stress. Eine pathogene Störung der Funktion des eIF2B‑Komplexes ist mit der Vanishing‑White‑Matter‑Leukodystrophie und verwandten eIF2B‑Spektrum-Erkrankungen assoziiert, was EIF2B5 zu einem wichtigen Ziel für mechanistische Studien der stressregulierten Translation macht.

eIF2Bε Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EIF2B5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

eIF2Bε Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EIF2B5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EIF2B5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen eIF2Bε-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EIF2B5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von eIF2Bε-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des eIF2Bε-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EIF2B5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.