EGFL8 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-429875-ACT

Egfl8 codifica a EGFL8, uma proteína secretada associada à matriz extracelular que contém domínios semelhantes a EGF e que dá suporte à comunicação célula–célula e célula–matriz. Em tecidos de camundongo, a expressão de EGFL8 tem sido associada à regulação do padrão de desenvolvimento, ao comportamento de células epiteliais e endoteliais e a processos de remodelamento extracelular que influenciam a adesão, a migração e a organização tecidual. Por meio dessas funções, a EGFL8 é relevante em contextos de sinalização que coordenam a morfogênese e as interações estroma–parênquima, incluindo vias que fazem interface com programas responsivos a fatores de crescimento. Assim, a atividade ou expressão alterada de EGFL8 é estudada em modelos de remodelamento tecidual desregulado e de biologia de doenças proliferativas, nos quais mudanças no microambiente podem moldar o destino celular e fenótipos associados à invasão.

EGFL8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Egfl8 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

EGFL8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Egfl8 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Egfl8, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de EGFL8. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Egfl8 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de EGFL8 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via EGFL8 em células tumorais com expressão de Egfl8 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.