dystrophin CRISPR Activation Plasmid (m): sc-420021-ACT

Dmd kodiert Dystrophin, ein großes zytoskelettales Protein, das das Aktin-Netzwerk mit dem Dystrophin‑Glykoprotein‑Komplex am Sarkolemm verbindet und so die Membranstabilität während der Muskelkontraktion unterstützt. In der Skelett- und Herzmuskulatur der Maus trägt Dystrophin zur Mechanotransduktion, zur Organisation der Kostamere und zur Aufrechterhaltung der Calciumhomöostase bei; bei verminderter Expression ergeben sich nachgeschaltet Effekte auf Entzündungs- und fibrotische Remodeling‑Signalwege. Eine Störung oder verminderte Funktion von Dystrophin ist mit fortschreitenden Muskelfaserschäden und beeinträchtigter Muskelintegrität assoziiert, wodurch Dmd ein zentrales Gen für die Untersuchung von Muskeldegenerations-Phänotypen darstellt. Dmd‑abhängige Prozesse sind zudem relevant für die Modellierung von Veränderungen in der Signalgebung der extrazellulären Matrix, von Stressantworten und von myonukleären Transkriptionsprogrammen in Kontexten neuromuskulärer Erkrankungen.

dystrophin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Dmd-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

dystrophin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Dmd-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Dmd-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen dystrophin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Dmd-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von dystrophin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des dystrophin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Dmd-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.