DPYD CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403396-ACT

Humanes **DPYD** kodiert die Dihydropyrimidin-Dehydrogenase, ein zytosolisches Flavoprotein, das die geschwindigkeitsbestimmende Reduktion von Uracil und Thymin katalysiert und damit den Pyrimidinabbau einleitet. Durch die Kontrolle des Pyrimidinumsatzes beeinflusst **DPYD** die Nukleotidhomöostase, das Gleichgewicht von RNA-/DNA-Vorstufen sowie zelluläre Antworten auf metabolischen Stress. Eine veränderte **DPYD**-Aktivität wurde mit angeborenen Störungen des Pyrimidinstoffwechsels und mit Unterschieden in der Verarbeitung von Fluoropyrimidinen in Verbindung gebracht, was diesen Stoffwechselweg mit neuroentwicklungsbezogenen und pharmakogenomischen Forschungskontexten verknüpft. **DPYD** ist daher ein nützlicher Knotenpunkt, um metabolische Regulation, Redoxbiochemie und Effekte auf Signalweg-Ebene auf Proliferation und zelluläre Fitness zu untersuchen.

DPYD Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DPYD-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DPYD Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DPYD-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DPYD-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DPYD-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DPYD-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DPYD-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DPYD-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DPYD-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.