DOCK 2 CRISPR Activation Plasmid (m2): sc-430116-ACT-2

Das Mausgen Dock2 kodiert DOCK2, einen auf hämatopoetische Zellen beschränkten Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor, der Rac-GTPasen aktiviert und dadurch den Umbau des Aktin-Zytoskeletts sowie die gerichtete Migration in Lymphozyten, Neutrophilen und anderen Immunzellen steuert. DOCK2 wirkt nachgeschaltet von Chemokinrezeptoren und der Antigenrezeptor-Signalgebung und koordiniert integrinabhängige Adhäsion, die Bildung der immunologischen Synapse und den Transport durch lymphoide Gewebe über Signalwege, die die PI3K-Signalgebung mit der Regulation von GTPasen der Rho-Familie verknüpfen. Genetische und funktionelle Störungen von DOCK2 sind mit beeinträchtigten angeborenen und adaptiven Immunantworten assoziiert und wurden in experimentellen Systemen mit entzündlichen und autoimmunähnlichen Phänotypen, erhöhter Infektanfälligkeit sowie veränderter Tumor-Immunüberwachung in Verbindung gebracht. Die Geneditierung von Dock2 in der Maus unterstützt mechanistische Studien zur Leukozytenmotilität, Chemotaxis und Umprogrammierung von Signalnetzwerken und ermöglicht die zellintrinsische Analyse von Immunzellen in Modellen für Entzündung, Wirt-Pathogen-Interaktionen und immunonkologische Forschung.

DOCK 2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Dock2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DOCK 2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Dock2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Dock2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DOCK 2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Dock2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DOCK 2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DOCK 2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Dock2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.