DMPK Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402727-ACT

Il gene umano DMPK (dystrophia myotonica protein kinase) codifica una chinasi serina/treonina particolarmente espressa nel muscolo e coinvolta nell’organizzazione del citoscheletro, nell’adesione cellulare e nella regolazione della differenziazione miogenica. L’attività di DMPK interagisce con la dinamica actina–miosina e con reti di segnalazione che coordinano l’eccitabilità muscolare e l’integrità strutturale, supportando processi quali la contrazione e il rimodellamento cellulare. L’espansione patogena delle ripetizioni CTG nel locus DMPK è geneticamente associata alla distrofia miotonica di tipo 1, in cui una disregolazione mediata dall’RNA contribuisce a effetti diffusi sullo splicing alternativo e sulla funzione muscolare. Queste caratteristiche rendono DMPK un bersaglio rilevante per lo studio della segnalazione chinasi nella biologia muscolare, della fisiopatologia neuromuscolare e della regolazione trascrizionale in loci associati alla malattia.

DMPK Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DMPK senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DMPK Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DMPK nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DMPK, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DMPK. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DMPK nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DMPK nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DMPK nelle cellule tumorali con espressione di DMPK silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.